摘要

创伤，肿瘤以及整形手术经常会引起严重的骨缺损。自体骨移植材料受到供体的限制很难得到与骨缺损部位相匹配的外形，因此针对特定的骨缺损部位制备出个性化的骨支架材料具有重要意义。增材制造（3D打印）技术是一种计算机辅助成型技术，其优势在于能够精准、快速地实现支架宏观外形与微观结构的精确构建，并实现个性化的组织修复与再生。目前合成聚合物聚己内酯（polycaprolactone, PCL）和天然高分子明胶（gelatin, Gel）已广泛用于构建骨支架，但由于明胶力学性能欠佳，在3D打印中常采用甲基丙烯酰化的明胶（GelMA）与PCL等混合来制备三维骨支架。

本研究在前期研究的基础上，选择冰乙酸作为溶剂，直接使用未改性的Gel与PCL和纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite, n-HA）构建了新型打印墨水（图1）。这种墨水具有优异的结构保真度、结构分辨率等打印适配性，通过3D打印易于制备出不同尺寸和结构的三维骨支架，且支架表现出优异的生物相容性和细胞黏附性，以及优异的体内成骨性能。该研究结合了Gel，PCL和n-HA的不同特性，凸显了各组分在骨组织工程支架中的优势，为临床个性化骨缺损修复提供了一个有前景的3D打印策略和创新解决方案（论文一作王晨鑫 博士，通讯作者邹琴 副研究员，李玉宝 教授）。

材料与方法

在这项研究中，研究者首先采用冰乙酸作为溶剂，分别溶解不同浓度的Gel和PCL。随后将优选的最适浓度的两种溶液混合并加入n-HA搅拌均匀，得到了3D打印复合生物材料墨水，并对墨水的打印性进行分析，筛选合适的打印条件。n-HA含量50% (w/w)，打印温度10–15 °C，打印气压2.5 bar，打印速度7 mm/s，为Gel/PCL/n-HA 3D打印墨水的最佳打印条件（图2）。

图1 新型挤出式3D打印骨修复支架的制备

标注文字：NH, Gel, NH, Pressure: 2.5 bar, NH, PCL, Nozzel diameters: 0.41mm, Print speed:7 mm/s, n-HA, Mixture, Biomaterial inks, 3D Printing, Cross-linking, Temperature, Gelatin, Temperature ↑, PCL, -80°C Freezing, GPHg0, GPH60, GPH45, Vanilin/C₂H₂ OH, Bone repair, Osteogenesis

图2 Gel/PCL/n-HA生物材料墨水的可打印性分析

(A) 不同浓度Gel/乙酸和PCL/乙酸的溶解情况；(B) 不同组分对墨水流动性的影响，橙色虚线表示样品瓶中材料上表面；(C) 不同n-HA含量对墨水打印性的影响，其中绿色、蓝色和黄色表示不稳定状态，红色表示稳定状态；(D) 打印速度和压力的筛选，黄色虚线框表示最佳打印出丝状态

Gel/PCL/n-HA 3D打印生物材料墨水可以打印出多种角度的曲线，并且出丝平滑、均匀，具有很高的保真度和优异的自支撑性。之后通过Perfactory RP软件设计了三种不同的二维打印路径，通过挤出式3D打印技术逐层打印，获得不同结构的Gel/PCL/n-HA复合支架（GPH支架），分别命名为GPH45 (0°/45°/90°/135°)，GPH60 (0°/60°/120°)，GPH90 (0°/90°)（图3）。

图3 Gel/PCL/n-HA墨水的高保真3D打印结果

(A) 锐角、直角和钝角的线性打印，蓝色箭头：拐角处的材料沉积；(B) 反“S”型设计，(B1) 3D Max中的3D设计图，以及设计尺寸的表示，(B2-B4)照片显示印刷反“S”图案，黄色虚线：缺失部分，红色虚线圈：材料沉积，(B5) 打印长丝的支撑稳定性；(C) GPH45、GPH60、GPH90三种支架的最终形态

GPH支架展现出良好的三维多孔结构，但在室温空气环境下会逐渐坍塌。将GPH支架分别在不同温度下（4 °C，0 °C，-20 °C，-80 °C）冷冻12 h后取出，浸泡于去离子水中，发现支架坍塌。对不同温度冷冻固化后的支架进行化学交联以增强其稳定性。交联后，常温下支架放入去离子水中，经4 °C、0 °C和-20 °C冷冻的支架仍在水中坍塌，-80 °C冷冻交联后的支架可保持长期的稳定性。

图4 GPH支架冷冻交联示意图

(a) 室温下Gel分子链分布（RT：20-30 °C）；(b) Gel冷冻后的分子链；(c) 香兰素交联后Gel的分子链；①-④：不同交联条件下GPH支架在水中浸泡后的状态

结果

将GPH支架与MG63细胞共培养，对GPH支架的细胞相容性进行表征。SEM和CLSM结果均显示细胞在支架表面黏附生长良好。TEM结果显示，MG63细胞紧密黏附在支架表面，支架中的n-HA释放后经胞吞作用进入细胞中（图5）。

图5 GPH支架体外细胞相容性分析

(A1-A2) MG63细胞与支架共培养的SEM图；(B1-B4) CLSM图像，蓝色：细胞核，绿色：线粒体，红色：肌动蛋白；(C1-C2) MG63细胞黏附和n-HA内吞的TEM图（M：支架材料，白色箭头：内质网，黄色三角形：线粒体）

通过兔股骨滑车沟骨缺损模型，将三种不同结构的支架植入缺损区域，观察4周，8周和12周的骨再生和体内支架降解情况。Micro-CT分析结果显示，术后4周，新生骨组织仅在支架周围形成薄层；8周时，新骨增多并且从支架外围沿着支架向内延伸；到第12周时，新生骨组织明显增厚。支架随着植入时间的延长，逐渐降解。降解过程中仍能较好保持三维多孔结构（图6）。

图6 GPH支架降解及骨修复实验的Micro-CT结果

(A) 兔股骨滑车沟支架植入示意图；(B) 股骨髁及缺损区域复合支架（黄色）的三维（3D）重建图像；(C) 二维（2D）横断面图像，红色圆圈表示缺损区域；(D) 三维重建后的缺损区域骨再生（4、8、12 W）；(E) 缺损区域新生骨的可视化骨小梁厚度，其中红色程度越高，骨小梁厚度越厚

H&E染色结果显示，GPH支架具有良好生物相容性，植入体内12周无炎症反应，并且可观察到明显的支架降解（图7）。

图7 GPH支架植入股骨髁后横切面组织学分析

各组在4、8、12周的H&E染色结果。下图是上图蓝色方块的放大图，黄色箭头表示炎症细胞，M为支架材料

此外，Masson染色结果显示，GPH支架具有良好的成骨性能。12周时，在支架周围形成了许多成熟的骨组织，并且大量胶原纤维通过支架孔隙沉积在缺损区域（图8）。

图8 三组GPH支架植入缺损后的Masson染色结果

各组在4、8、12周的Masson染色结果。下图是上图中黄色方块的放大图，绿色箭头表示成骨细胞，NB表示新骨组织

结论与致谢

综上所述，该研究开发了一种新型明胶基生物材料3D打印墨水。此墨水具有优异的打印适配性（如结构保真度，结构分辨率等），同时实现了明胶在挤出式3D打印中的应用。由此挤出式生物3D打印机制备得到的三维支架能有效促进骨缺损愈合，在骨修复方面具有巨大潜力。

四川大学分析测试中心 博士生 王晨鑫 是该论文的第一作者，邹琴 副研究员和李玉宝 教授为通讯作者。该研究得到了国家重点研究计划项目(2021YFA1201300)、四川大学2021年度研究生教育创新与改革项目、分析测试中心分析测试技术创新项目的资助。